1. Les acides nucléiques

a) Structure des nucléotides

Un acide nucléique est l’association d’une base azotée avec un sucre et un acide phosphorique.

On distingue 2 types de bases azotées :

Pyrimidiques, à un cycle : Cytosine, Thymine, Uracile.
Puriques à deux cycles : Adénine et Guanine.

Les sucres impliqués dans la structure du génome sont le Ribose (ARN) et le Désoxyribose (ADN).

Pour former une molécule d’ADN, les nucléotides sont liés par liaison ester covalente (entre un alcool OH et un acide carboxylique COOH).

Le sens conventionnel d’écriture des molécules d’ADN est le suivant : extrémités 5’P vers 3’OH.

b) Structure de l’ADN

Après leur association, les bases vont s’organiser en double hélice avec 2 chaînes antiparallèles et complémentaires (une base purique toujours en face d’une pyrimidique).

A + T C + G
2 liaisons hydrogènes 3 liaisons hydrogènes

c) Les acides nucléiques en solution

Les acides nucléiques ont des propriétés acido-basiques (l’ADN se comporte comme un polyacide fort).

Les sucres sont solubles dans l’eau.

Les groupements phosphates sont ionisés (chargés) au dessus d’un pH = 4.

d) Extraction des acides nucléiques (AN)

Les nucléases sont des enzymes dégradant l’ADN. Lorsqu’on extrait ce dernier, il faut donc les neutraliser pour conserver son intégrité. On se sert donc de l’EDTA qui chélate (capture) les ions Ca2+ et Mg2+ indispensables au fonctionnement des nucléases.

Avec une bactérie, il est préalablement nécessaire de lyser la paroi et la membrane pour accéder aux AN.

Un tissu sera broyé puis soumis à une solution hypotonique pour faire éclater les cellules.

Une fois qu’on a accès à l’ADN, le protocole est le même :

  1. Séparation de l’ADN et des protéines : mélange de détergent (SDS) et de protéinase (K).
  2. Extraction organique (phénol) : déprotéinisant puissant qui place les AN en phase aqueuse.
  3. Traitement au chlorophorme : permet d’éliminer les traces de phénol.
  4. Éthanol >96° : son affinité avec l’eau déshydrate les AN et les fait précipiter dans un culot.

e) Dosage des acides nucléiques

Le maximum d’absorption des bases azotées est situé à 260 nm. Celui des protéines est à 280nm.

Avant le dosage, il faut donc vérifier la pureté de l’échantillon car les protéines peuvent fausser la mesure.

On définit donc le rapport qui doit être supérieur ou égal à 1,8.

Pour le dosage, on définit ces valeurs :

ADN ARN
1 DO = 50µg/mL 1 DO = 40µg/mL

f) Dénaturation de l’ADN

La dénaturation désigne le passage d’une molécule d’ADN bicaténaire à deux brins d’ADN distincts.

Il existe une température de fusion (Tm) qui provoque la dissociation des 2 brins d’ADN.

Tm = température à laquelle 50% de l’ADN est dénaturé.

Plus la dénaturation s’intensifie, plus la DO augmente : c’est l’effet hyperchrome.

On a vu que les bases C et G étaient liés plus intensément que les bases A et T. Ainsi, si la proportion de bases C et G augmente dans la molécule d’ADN, la température de fusion sera plus importante.

Si la température baisse brutalement, il n’y a pas de renaturation de l’ADN.

2. Les différents génomes

a) Génome procaryote

b) Génome eucaryote

ADN Chromosomique

Cet ADN double brin est dans le noyau et est associé à des histones (5 protéines différentes : H1, H2A, H2B, H4 et H1) pour former les nucléosomes (200pb de longueur). Cela forme une structure en « collier de perle » qui s’appelle la chromatine. Voir ce cours pour en savoir plus.

Chromatine = ADN + Protéines histones.

ADN Chromosomique

Cet ADN code les ARN outils (ARNt et ARNr) et 13 protéines de la chaîne respiratoire. Il est hérité de notre mère et mesure 16.103 pb.

ADN Chloroplastique

Il code également des ARN outils et des protéines mais ce sont celles de la photosynthèse. Il est DB, circulaire et mesure entre 140 et 200.103pb.

3. Réplication de l’ADN

La réplication de l’ADN est le processus qui permet la synthèse d’un brin complémentaire depuis un brin matrice. La réplication de chacun des brins d’une molécule d’ADN conduit donc à la formation de 2 molécules à 2 chaînes.

La réplication est dite « semi conservative » car un brin est conservé à chaque réplication.

a) Point d’initiation et déplacement des fourches de réplication

Les points d’initiation de la réplication sont des séquences nucléotidiques appelées « séquences ori ».

Elles ont une structure palindromique (qui se lit dans les deux sens, comme kayak) et sont reconnues par des enzymes (ADN Polymérase).

Eucaryotes Bactéries
1 séquence ori / 40 000 pb 1 seule origine de réplication

La réplication est bidirectionnelle, l’ouverture de la molécule d’ADN crée des fourches de réplication.

b) Direction et vitesse de réplication

E. Coli Eucaryote
50 000pb/min ±3 000pb/min (mais plusieurs ori)

La synthèse des chaîne d’ADN se fait dans le sens 5’⇒3’ car l’ADN parental est lu en 3’⇒5’.

Au point d’initiation de la réplication, on distingue :

  • Le brin direct : synthétisé dans le sens d’ouverture de la fourche, il n’a besoin que d’une ori.
  • Le brin indirect (tardif) : synthétisé sous forme de petits fragments d’Okasaki.

c) Mécanisme moléculaire

1. Déroulement de l’ADN et maintien sous forme simple brin :

  • ADN Gyrase (sur le brin 3’⇒5’) et ADN Hélicase III (sur le brin 5’⇒3’) déroulent l’ADN
  • Protéines SSB : se lie sous forme tétramère et « rigidifient » l’ADN pour éviter la réassociation.

2. Mise en place d’une amorce ARN

  • On a 4 protéines : i, n, n’ et n’’ qui reconnaissent le site de réplication.
  • Leur fixation attire les protéines DNA B et DNA C (constituent le ribosome).
  • Ceci attire DNA G qui est une ARN primase qui va pouvoir synthétiser l‘amorce ARN.

3. Croissance des brins

  • La réplication est assurée par l’ADN pol III.
  • L’ADN ligase soude les fragments d’Okasaki.

4. Mécanisme d’action de l’ADN Pol

Elles sont seulement capables d’étendre l’ADN et donc nécessitent une amorce. Elles ont deux mécanismes d’action :

  • Pré-synthétique : système qui détermine à l’avance le choix du bon nucléotide.
  • Post-synthétique : soumet n’importe quel nucléotide à l’extrémité 3’ et l’enlève puis le remplace s’il est mauvais.

Chez les procaryotes, les 2 mécanismes sont possibles mais chez les eucaryotes, l’ADN Polymérase n’a pas d’activité exonucléasique (ne peut pas enlever de nucléotide) et marche donc selon le processus pré-synthétique.

5. Maturation de l’ADN

Après la réplication, le brin néosynthétisé est un mélange d’ADN et d’ARN (amorce). Une exonucléase retire donc les bases Uraciles de l’ARN pour les remplacer par des Thymines (ADN).

S’il y a erreur dans la réplication (problème dans le système pré-synthétique), il existe un système de correction des erreurs grâce à l’ADN pol III.

6. Les ADN polymérases des eucaryotes

On en distingue 4 :

4. Transcription de l’ADN

a) Définition

La transcription est un mécanisme qui permet à une région limitée d’ADN d’être recopiée en ARN simple brin.

Le brin recopié est appelé brin matrice, l’ARN est complémentaire et antiparallèle à ce brin.

Grâce à ce mécanisme, on peut donc obtenir des ARN outils (ARNr et ARNt) ou des ARNmessagers qui serviront à la synthèse protéique.

b) La transcription chez les procaryotes

ARN Polymérase

L’ARNpol des procaryotes a 5 sous-unités (α, β, β’, ω, σ). C’est grâce à la sous-unité σ que l’enzyme reconnaît les séquences promotrices : elle joue le rôle de facteur d’initiation de transcription.

La lecture du brin matrice se fait dans le sens 3’ ⇒ 5’. L’ARN est synthétisé dans le sens 5’ ⇒ 3’.

Initiation et séquences promotrices

L’initiation de la transcription se fait au niveau du promoteur, qui présente des séquences consensus. Chez les bactéries, il existe 2 séquences consensus en position -35 et -10. Le site d’initiation est en position +1, au niveau d’une purine (A ou G).

La séquence en -10 est la TATABOX. Elle est composée de 6 nucléotides : TATATT ou TATAAT.

C’est le site d’ouverture de l’ADN double brin.

La séquence -35 est une séquence TTGACA, c’est elle qui est reconnu par la sous-unité σ.

Terminaison

C’est une séquence particulière que l’enzyme reconnaît qui constitue un signal de terminaison. Il existe 2 types de terminaisons :

b) La transcription chez les eucaryotes

ARN polymérases

Ces polymérases ne se fixent pas directement sur les promoteurs car elles nécessitent des facteurs de transcription (TF).

Séquences promotrices

Facteurs de transcription

Les TF sont des protéines qui se lient à l’ADN pour rendre fonctionnels les promoteurs et attirer spécifiquement les ARNpol.

Signaux de terminaison

Maturation du pré-ARN messager

  • Mise en place d’une coiffe en 5’ : nucléotide G méthylé (protège l’ARNm).
  • Polyadénylation en 3’ : ajout de 100 à 200 bases A en 3’OH (sert à l’exportation des ARNm dans le cytosol)
  • Épissage des introns : dans un gène, les exons sont exprimés et les introns sont des intrus.

5. La traduction

a) Agents de la traduction

ARNt

Cet ARN permet le transfert des acides aminés.

  • β est la tige acceptrice : là où se fixe l’acide aminé (aa).
  • La boucle A de l’anticodon reconnaît et s’associe aux codons de l’ARNm
  • Les autres boucles et bras servent à la fixation sur le ribosome

L’attachement de l’aa à l’ARNt est assuré par l’aminoacyl ARNt synthétase (1 par aa).

Il y a un ARNt par acide aminé mais il peut y avoir plusieurs ARNt pour un acide aminé : ils sont iso-accepteurs.

ARNm (messager)

Sur l’ARNm, les acides aminés sont lus trois par trois. Ce sont les codons et il en existe 64 dont 3 codons stop, qui arrêtent la traduction : UAG, UAA et UGA.

Il y a 61 codons pour 20 acides aminés : le code génétique est dégénératif, plusieurs codons codent un acide aminé.

Le ribosome

C’est une grosse molécule ribonucléoprotéique (ARNr + protéines) composée d’une grande et d’une petite sous-unité :

  • La grande sous-unité catalyse la formation de liaisons peptidiques.
  • La petite sous-unité initie la traduction.
Procaryote Eucaryote
Ribosome 70s Ribosome 80s
Grande = 50s* (ARNr 23s et 5s),    petite = 30s* (ARNr 16s) Grande = 60s* (ARNr 5s, 28s et 5,8s), petite = 40s* (ARNr 18s)

Le S ici désigne l’unité svedberg, qui est un coefficient de sédimentation.

b) Mécanisme de traduction chez les procaryotes

La traduction s’opère en 3 étapes : initiation, élongation et terminaison.

Initiation

L’initiation a lieu a lieu au niveau d’un codon initiateur AUG (codant une méthionine).

En amont de ce codon, on retrouve la séquence Shine-Dalgarno (AGGAGGU) qui permet la fixationde la petite sous-unité du ribosome.

Pour que cette petite sous-unité se fixe, elle doit se dissocier de la grande : c’est le facteur d’initiation IF-3 qui empêche l’association des deux sous-unités.

IF-2 intervient et permet la reconnaissance avec fMet-ARNt. C’est l’ARNt portant l’aa Méthionine formylé, qui est le premier dans la chaîne peptidique.

Après la fixation de cet ARNt, IF-3 et IF-2 se dissocient du complexe et la grande sous-unité du ribosome est recrutée.

Élongation

Le 2ème ARNt ne peut venir se fixer au ribosome seulement s’il est couplé à un facteur d’élongation : EF-Tu.

Une liaison peptidique vient lier les 2 aa. C’est la peptidyl transferase qui assure la formation de cette liaison.

L’ARNt déchargé est ensuite éliminé, il quitte le ribosome et laisse la place libre à un autre ARNt.

Terminaison

Il existe 3 codons stops qui n’ont pas d’ARNt complémentaire.

Lorsqu’un de ces codons atteint le ribosome, des protéines RF (Release factor = facteur de relargage) vont se lier au codon stop et modifier l’activité de la peptidyl transferase : la chaîne peptidique quitte le ribosome.

Modification de l’extrémité NH2 terminale

Le premier acide aminé est une formylMet : une déformylase enlève le groupement formyl.

La correction des erreurs de traduction s’opère à 2 niveaux : l’aminoacyl ARNt synthétase peut hydrolyser les aa incorrects et EF-Tu contrôle les liaisons H. Si elles sont incorrectes, l’ARNt quitte le ribosome.

c) Les mécanismes de traduction chez les eucaryotes

Initiation

Les facteurs d’initiation chez les eucaryotes sont notés eIF.

  • L’ARNt initiateur se couple à eIF-2 et la petite sous-unité s’associe à eIF-3 et eIF-1a.
  • Ceci permet d’éviter l’association entre la grande et la petite sous-unité du ribosome et de maintenir l’association ARNt initiateur/ petite sous-unité (Complexe d’initiation 43s).
  • L’ARNm qui entre en traduction se couple avec eIF-4. Le complexe 43s se fixe à cet ARN pour former le complexe 48s.
  • L’ARNm est ensuite circularisé grâce à une PolyA binding proteinpour vérifier sa bonne qualité (présence de la coiffe en 5’ et de la queue polyA en 3’)

Élongation

  • eIF-4, eIF-2 et eIF-3 quittent la petite sous-unité du ribosome pour que la grande puisse s’associer.
  • Les ARNt porteurs d’aa sont couplés à eEF-1a (similaire à l’EF-Tu des procaryotes) afin de contrôler si c’est le bon aminoacyl qui arrive en traduction.

Ce sont les protéines eRF qui vont arrêter la traduction.

Terminaison

Une endopeptidase clive la Methionine en position NH2 terminale.

6. Les mutations

a) Généralités

Les mutations peuvent concerner un seul nucléotide : SNP (single nucleotide polymorphism) ou être une addition/une délétion de plusieurs nucléotides. Elles sont spontanées.

Leur fréquence d’apparition est d’environ 10-7, ce qui signifie que pour 107 bactéries, il y en a une mutée.

b) Les différents types de mutations

Mutations spontanées

Changements induits

Il existe des mécanismes de réversion : des mutations qui reproduisent l’acide aminé présent initialement. On en distingue 2 :

  • La réversion vraie où le triplet redevient identique
  • La réversion équivalente où le triplet code un acide aminé équivalent

Agents mutagènes

Bien que spontanées, les mutations peuvent être favorisées par certains produits : les agents mutagènes.

c) Réparation de l’ADN

Par excision 

Des endonucléases de réparation (Uvr) éliminent les bases endommagées. L’ADNpol I bouche la brèche et l’ADN ligase ressoude les morceaux.

Réparation spécialisée 

Le principe est le même mais fonctionne avec des endonucléases apuriques et apyrimidiques qui sont spécialisées.

Élimination des lésions 

Réparation des alkylations des bases par la méthyl-guanine-méthyl-transferase.

Recombinaison 

En face d’un dimère de thymine par exemple, il y a une brèche dans l’ADN. La protéine RecA coupe une séquence de l’ADN matrice dans une molécule sœur et l’emmène dans la brèche.

Réparation SOS 

Arrêt de la réplication en cas de lésions trop importantes. La protéine RecA panique et active une activité protéolytique qui va détruire un répresseur du système de réparation SOS (augmente la synthèse de RecA et d’Uvr).

7. L’organisation des gènes

Rappel : un gène est un fragment d’ADN portant toute l’information nécessaire pour coder une macromolécule (protéine, ARN…).

a) Les différents éléments d’un gène

Les gènes possèdent une zone de contrôle qui régule une zone transcrite.

Les signaux qui modulent la transcription sont des protéines.

b) Organisation des gènes chez les procaryotes

Dans le génome bactérien, il y a très peu d’ADN non codant.

Plusieurs zones transcrites sont sous la dépendance d’une même zone de contrôle : l’opéron.

Chaque zone transcrite comporte un cistron.

On retrouve ce cycle d’organisation pour les protéines intervenant dans une même voie métabolique : un seul signal active ou inhibe la synthèse de toutes les protéines impliquées dans une voie en agissant sur l’opéron.

c) Organisation des gènes chez les eucaryotes

Seul 10 % du génome est codant. 90 % du génome est donc composé de séquences répétées, d’introns et de zones de contrôles : plusieurs zones de contrôles peuvent réguler l’expression d’une zone à transcrire ce qui permet une expression différentielle le type cellulaire.

8. Régulation de l’expression des gènes chez les procaryotes

a) Notion d’opéron

L’opéron est l’unité d’expression des gènes bactériens. Il est constitué de gènes de structure (les cistrons) et de séquences permettant l’expression ou non des cistrons (les promoteurs). On y retrouve également un opérateur et un répresseur.

Il existe 2 grands groupes d’opérons :

  • Les opérons inductibles impliqués dans le catabolisme
  • Les opérons répressibles impliqués dans l’anabolisme.

b) Opéron inductible (lactose)

Le gène lac I code un répresseur qui possède une forte affinité pour l’opérateur, empêchant donc la transcription du gène codant la β-galactosidase. Au contact du lactose, il n’a plus aucune affinité pour l’opérateur : il y a transcription de cette enzyme et donc dégradation du lactose.

L’opéron lactose possède 3 cistrons :

Lac Z Lac Y Lac A
β-galactosidase :
dégrade le lactose
Perméase qui permet l’entrée du lactose
dans la cellule.
Transacétylase

Un autre système existe : la répression catabolique.

L’ARNpol a une faible affinité pour le promoteur du gène codant la β-gal, le niveau de transcription est donc bas. Lorsque la cellule reçoit un signal de faim cellulaire (pas de glucose), il y a une forte augmentation d’AMPc. Ce dernier se couple à une protéine cap qui va attirer l’ARN polymérase sur les promoteurs.

La transcription augmente donc. Ce système permet d’éviter la métabolisation du lactose s’il y a du glucose.

c) Opéron répressible

C’est le système inverse : les gènes sont transcrits tant que le produit final n’est pas en quantité sufisante.

Le répresseur n’a aucun affinité pour l’opérateur sauf lorsqu’il est couplé à un co-répresseur.

Le tryptophane est un exemple d’opéron répressible. En présence de suffisamment de Trp, les ribosomes sont bloqués.