1. Les sondes nucléiques

a) Introduction

Les sondes nucléiques sont des segments d’acides nucléiques (ADN ou ARN) qui repèrent des fragment d’acides nucléiques leur étant complémentaire.
Ces sondes simples brins peuvent mesurer entre 20 nucléotides (oligonucléotides) à plusieurs centaines.
Les sondes sont complémentaires et anti-parallèles d’un segment d’acide nucléique simple brin à reconnaître et peuvent ainsi le détecter parmi des milliards de fragments.
La sonde doit ensuite être repérable et doit par conséquent être marquée. Pour se faire, différents agents de marquage sont employés.

a) Agents de marquage

  • 32P : il s’agit d’un émetteur d’électrons. Ces derniers vont aller s’imprimer sur un film photographique et provoquer une tâche noire, c’est l’autoradiographie.
  • 35S : émet un rayon de faible énergie β.
  • Nucléotides TriPhosphate biotynlés : ces nucléotides sont repérables grâce à la streptavidine marquée par un fluorochrome ou à l’aide d’une enzyme.
  • Nucléotide triphosphate marqué à la fluorescéine : ces nucléotides vont s’incorporer dans la structure de la sonde.

b) Techniques de marquage

Nick translation (translation de césure)

La translation de césure ou Nick translation fait intervenir principalement deux enzymes :

  • Dnase I : provoque des coupures aléatoires sur l’ADN (après une base Pyrimidique).
  • ADN polymérase I 
    • activité exonucléique 3’ – 5’
    • activité polymérique 5’ – 3’

La chromatographie, qui permet la révélation, se fait sur colonne, ce qui permet à la sonde marquée d’être séparée des nucléotides libres).

Random Priming (multi amorçage)

Le random priming se réalise en 3 étapes :

  1. Dénaturation de l’ADN (à 100°C) : le refroidissement est brusque afin de maintenir sous forme simple brins les fragments.
  2. Mélange à de très nombreux hexanucléotides : la fixation aléatoire sur l’ADN dénaturé permet à l’ADN polymérase de s’amorcer.
  3. Ajout du fragment de Klenow (ADN polymérase I dépourvue d’activité exonucléasique).
  4. Chromatographie qui permet la séparation de la sonde marquée et des nucléotides libres.

Sulfonation des cytosines

La rencontre du sulfonate de sodium (NaSO4) et des acides nucléiques a pour conséquence de sulfoner les cytosines.
La détection se fait grâce à un anticorps monoclonal spécifique, lui même révélé par un anticorps secondaire marqué à la peroxydase ou à la phosphatase, qui sont des enzymes chromogènes. On parle de marquage enzymatique.

2. Dénaturation de l’ADN

Cette dénaturation peut être mesurable en spectrophotométrie. C’est grâce à l’effet hyperchrome : l’ADN simple brin absorbe plus que le double brin. Ceci dessine une courbe sigmoïdale.

a) Température de fusion (Tm)

La température de fusion est aussi appelée température de demi-dénaturation. Au delà de la température de fusion, il y a rupture des liaisons hydrogènes, ce qui provoque la séparation des deux brins

b) Facteurs influençant

Plus un fragment d’ADN est long, plus il y a de liaisons hydrogènes qui lient les deux brins. Par conséquent, lorsque la longueur du fragment augmente, l’énergie nécessaire à la séparation des deux brins qui le composent doit être plus importante.
La concentration en sel est également un facteur influençant : lorsqu’elle est basse (< 1 mol/L), la température de fusion est diminuée.

c) Renaturation

Afin d’obtenir une renaturation « parfaite », le refroidissement doit être progressif. La courbe de renaturation a alors le même aspect que la courbe de dénaturation.
Un refroidissement brutal empêche la renaturation.

3. Hybridation

a) Facteurs influençant l’hybridation

Concentration en ADN

Plus la concentration en ADN augmente plus on retrouve des copies complémentaires disponibles dans le mélange, augmentant ainsi l’efficacité de l’hybridation.

Temps de réaction

Plus on laisse de temps à la réaction pour opérer, plus les copies complémentaires auront de temps pour se rencontrer. Il y aura par conséquent plus d’hybrides.

Température

La ré-association et optimale lors que la réaction opère à 25 % de moins que la température de fusion.

Longueur des fragment

La vitesse d’hybridation est proportionnelle à la racine carrée de la longueur des fragments.

Concentration en sels

Lorsque la concentration en sel augmente, la vitesse d’hybridation fait de même (jusqu’à [Na+] = 1,2 mol/L).

Complexité des séquences

Dans un mélange, plus les séquences sont différentes moins il y a de chances pour un brin d’ADN d’aller s’hybrider. L’hybridation est ainsi ralentie.

La nature des acides nucléiques

Lorsque l’ARN est en large excès, la vitesse d’hybridation est identique à une situation ADN/ADN.
Quand c’est l’ADN qui est en excès, la vitesse d’hybridation est 5 fois plus faible que dans une situation normale.

b) Calcul de la température de fusion

  • Dans le cas d’un oligonucléotide < 20 nucléotides :

(A+T)*2 + (C+G)*4= Tm (°C)

Dans ce genre de formule, le A désigne le nombre d’adénine du fragment, T pour la thymine, A pour l’adénine et G pour la guanine.

L’hybridation quant à elle est optimale à -25 % de la température de fusion.

  • Dans le cas d’un oligonucléotide > 20 nucléotides :

[(A+T)*2 + (C+G)*4] * (1 + (N-20)/20) = Tm

  • Pour des valeurs plus exactes, différentes corrections sont faites en fonction de la concentration en sel et en formamide et des misappariements

4. Hybridation sur membrane

Dans cette méthode, le mélange d’acides nucléiques est immobilisé sur une membrane pour l’hybridation.

a) Les différents types de membranes

Nitrocellulose

Cette membrane fixe de manière irréversible les acides nucléiques après traitement à 80°C.
Le faible bruit de fond lors d’hybridation avec des sondes oligonucléotidiques est un des points forts de cette membrane. Par contre, elle est fragile et donc difficile à manipuler. De plus, elle ne permet pas d’hybridation successives.

Nylon

Cette membrane établit des liaisons covalentes des acides nucléiques après traitement aux UV.
Elle permet des cycles hybridation/ déshybridation.

b) Techniques d’immobilisation

Dot blot

Les acides nucléiques sont déposés sur la membrane sous forme de points.

Slot blot

Les acides nucléiques sont déposés sous forme allongée.

Southern blot

Transfert d’ADN d’un gel d’électrophorèse à une membrane.

  • Migration des acides nucléiques dans un gel d’électrophorèse (ADN dénaturé uniquement).
  • Transfert des acides nucléiques par capillarité ou à l’aide d’un champ électrique (les acides nucléiques nucléiques migrent vers le positif)
  • Révélation par autoradiographie

Lorsque c’est de l’ARN qui est utilisé, on parle de northern blot.

Colony blot

Transfert de colonies d’une boîte de pétri à la membrane. Une fois les colonies placées, elles sont lysées et la dénaturation est réalisée in-situ.

c) Les étapes de l’hybridation

Pré-hybridation

Les membranes sont traitées à l’aide d’un ADN qui va se fixer à tous les endroits ne contenant pas déjà des acides nucléiques.

Hybridation

Ce terme désigne la mise en contact avec de la membrane pré-hybridée et de la sonde. Cette réaction doit être effectuée dans le respect des conditions d’hybridation (température, concentration en sel, temps).

Lavage

Le lave permet d’éliminer les sondes qui ne se sont pas fixées. Il n’induit pas de déshybridation.

Révélation

Plusieurs moyens sont à disposition pour permettre la révélation : l’autoradiographie ou l’utilisation d’un substrat chromogène.

5. Applications

L’hybridation permet de rechercher de l’ADN correspondant à une information génétique et permet ainsi de repérer des anomalies (expression anormale, présence d’ADN exogène etc.).

Cette méthode permet la recherche d’ARN messager et ainsi d’identifier ou de quantifier l’expression d’un gène.

Il est également possible de mettre en évidence la présence d’un gène sur un chromosome.

6. Autres types d’hybridation

  • En milieu liquide
  • In-Situ : permet de savoir quel type cellulaire dans un tissu synthétise l’ARNm recherché. Après la coupe du tissu, les cellules sont perméabilisées puis les sondes sont ajoutées.
  • Par microscopie électronique : recherche de zones d’homologie entre 2 ADN d’origines différentes . Ces zones sont appelées hétéroduplex.
  • Les biopuces à ADN (macroarrays sur membranes et microarrays sur lame de verre) où sont greffées des sondes d’acides nucléiques.
  • Greffe des sondes d’AN
  • La lame subit un traitement acide qui met des groupements -NH2 qui ont pour fonction l’ancrage des sondes
  • In-situ