Une technique immunologique consiste en l’utilisation d’anticorps monoclonaux ou polyclonaux afin de répérer la présence d’un antigène ou d’une protéine d’intérêt.

Le complexe antigène/anticorps, appelé complexe immun est de haute affinité, réversible et spécifique, en dehors des réactions croisées.

1. Obtention des anticorps d’intérêts d’intérêt

a) Anticorps polyclonaux et monoclonaux

Anticorps polyclonaux

Le terme de « polyclonaux » désigne un mélange de différents anticorps, plus ou moins purifiés et/ou d’affinité diverses pour l’antigène et/ou reconnaissant des épitopes différents et/ou de classe et de sous classe différentes.

Anticorps monoclonaux

Les anticorps monoclonaux ne sont pas un mélange mais un seul type d’immunoglobines (=anticorps) toutes identiques, reconnaissant un unique épitope avec la même affinité, fabriquées par un seul clone de lymphocytes B.

Antigène

Un antigène est une molécule complexe qui comporte plusieurs épitopes.

b) Obtention d’anticorps polyclonaux

Immunisation d’un animal

Le terme d’immunisation désigne l’administration délibérée d’un antigène dans le but d’induire une réponse avec production d’anticorps.

Cette immunisation nécessite l’établissement d’un protocole d’immunisation :

  • Couplage de l’antigène à une protéine-porteuse si l’Ag est un haptène (substance réagissant avec l’anticorps mais incapable à elle seule de provoquer sa formation)
  • Déterminer la dose d’antigènes
  • Ajout d’un adjuvant (Alun)afin de retarder la libération de l’antigène et d’attirer les cellules présentatrices d’antigène
  • Déterminer le nombre d’injections et leur étalement dans le temps
  • Déterminer la voie d’immunisation (Intra-veineuse, Intra-péritonéale etc.)

Purification d’anticorps polyclonaux

Le sang, privé des cellules et des facteurs de coagulation nous donne le sérum(ou antisérum, immuno-sérum). C’est à partir du sérum que l’on purifie les anticorps (totales, d’une classe particulière ou d’une affinité particulière)

  • Techniques de purification

Afin de purifier les anticorps depuis le sérum, de nombreux procédés sont à disposition. Ils peuvent être chimiques (précipitation au sulfate d’ammonium ou à l’éthanol) ou physiques (ultracentrifugation).

Des méthodes chromatographiques peuvent aussi être mises en jeu afin d’extraire les anticorps polyclonaux. On retrouve par exemple la chromatographie sur résine échangeuse d’ions, le gel filtration ou encore l’HPLC (high pressure liquid chromatography)

La chromatographie d’affinité est également une technique envisageable puisqu’elle permet la sélection des immunoglobulines totales sur colonne de protéines, sur billes ou sur résines couplées à l’antigène d’intérêt.

Avantages et inconvénients

  • Avantages

Les techniques d’obtention des anticorps sont relativement simples. Comme ces anticorps sont polyclonaux, il y a reconnaissance de plusieurs épitopes différents, les immunoglobulines sont donc moins sensibles aux conditions physico-chimiques et aux légères variations d’épitope.

  • Inconvénients

Le produit obtenu est hétérogène, difficilement reproductible d’un animal à l’autre. Selon le degré de purification, il y a donc un risque plus ou moins élevé de réactions parasites.

c) Obtention d’anticorps monoclonaux

Principe général d’obtention

Les anticorps monoclonaux sont plus difficiles à obtenir car ils sont très spécifiques et tous identiques, leur obtention se déroule en 4 étapes majeures :

  1. Fusion de lymphocytes B à des cellules immortellesappelées hybridomes
  2. Isoler chaque hybridome et le cultiver in vitro.
  3. Identifier un hybridome sécrétant l’anticorps d’intérêt
  4. Purifier indéfiniment l’anticorps à partir du surnageant de culture

Avantages et inconvénients

  • Avantages

La spécificité des anticorps obtenus est unique, la reproductibilité est donc gage de qualité

De plus, c’est une technique au prix de revient intéressant, avec un bon rendement, et un intérêt pratique.

  • Inconvénients

La technique de préparation initiale des hybridomes est lourde et délicate et donne un seul type d’anticorps. Il y a donc une importante sensibilité à de légères variations d’épitopes.

d) Ingénierie des anticorps

Anticorps conjugués ou « couplés »

Un anticorps est dit conjugué lorsqu’il subit un couplage chimique à une autre molécule telle qu’un fluorochrome, une enzyme ou une toxine, ce qui permettra par la suite sa détection.

Anticorps recombinants

Une molécule est dite recombinante lorsqu’elle est produite par un organisme en milieu de culture. À partir d’un hybridome, on extrait des ARN messagers puis de l’ADN complémentaire (obtenu par transcription de l’ARN messager) que l’on clone dans un vecteur d’expression afin de l’introduire dans un organisme producteur.Les anticorps ainsi produits sont dits « recombinants ».

  • Intérêt majeur

On peut modifier les séquences afin d’améliorer ou de modifier l’affinité de l’anticorps pour un antigène donné. Il est également possible créer des anticorps chimères, c’est-à-dire constitué d’éléments provenant d’espèces différentes. Ceci est réalisé en combinant des séquences provenant d’espèces différentes.

  • Problème majeur

Les modifications post-traductionnelles sont indispensables à la fonction de l’anticorps et l’organisme producteur n’est pas forcément capable d’assurer ces modifications. De plus, les anticorps sont susceptibles de provoquer de fortes réactions immunitaires s’ils sont introduits dans un autre organisme.

Molécules recombinantes dérivées d’anticorps

Il est possible de modifier l’agencement des domaines V et C permettant de coder les anticorps afin d’en créer des « chimériques » (anticorps issus de la combinaison de séquences venues de plusieurs espèces) ou humanisés.

Utilisation thérapeutique des anticorps

Il existe une visée thérapeutique à l’utilisation des anticorps car ils sont injectablesà l’homme. Cependant, la molécule et ses modifications doivent être de type « humain » pour éviter une forte réaction immunitaire. (anticorps humanisés)

On retrouve donc :

  • Des anticorps à activité neutralisante
  • Des immunosuppresseurs
  • Des anticorps cytotoxiques car couplés à une toxine : cytolyse dirigée
  • Des anticorps à action agoniste ou antagoniste sur un récepteur : blocage des tumeurs par ex.

2. Réactions d’immuno-précipitation et d’immuno-agglutination

a) Principe général

Pour qu’il y ait formation d’un complexe immun de grande taille, l’antigène doit être multivalent et il doit y avoir équivalence des concentrationsen antigène et en anticorps : l’excès de l’un des deux entraîne une inhibition de la formation du complexe.

  • Trop d’antigène: probabilité pour deux anticorps de se fixer sur le même antigène trop faible.
  • Trop d’anticorps : probabilité qu’une immunoglobuline fixe deux antigènes trop faible.

b) Exemples de techniques d’immuno-précipitation

Immuno-électrophorèse (technique de Grabar et Williams)

Les anticorps sont déposés dans une gouttière creusée. La migration des antigènes le long de la gouttière se fait par électrophorèse. La détection est permise par une réaction immunologique qui forme un arc de précipitation entre les anticorps et les antigènes qui se diffusent.

Les dissymétries observées de part et d’autres des gouttières révèlent une anomalie sérique.

Immunodiffusion radiale (technique de Mancini)

Cette technique permet le dosage d’un antigène dans un échantillon à partir d’une gamme étalon.Ainsi, on peut par exemple :

  • Rechercher la présence de lait de vache dans le lait de chèvre ou inversement.
  • Contrôler l’origine exclusivement porcine de l’héparine extraite de muqueuse animale.

c) Exemples de techniques d’immuno-agglutination

Introduction

Les agglutinats sont provoqués par la rencontre d’un antigène multivalent et celle d’un anticorps spécifique.

On distingue 4 types d’agglutination :

Applications

  • Dosage de la protéine C-réactive (CRP).
    • Test TPHA, Treponema pallidum hemmoagglutination assay
      • Sérotypage des Salmonelles

      On utilise des anticorps spécifiques des différents sérotypes de Salmonelles, celui qui permet d’agglutiner la souche en définit le sérotype.

      3. Techniques immuno-enzymatiques

      a) Test ELISA

      ELISA = enzyme linked immunosorbent assay ou dosage immuno-enzymatique sur support solide.

      Des anticorps sont adsorbés sur une surface solide : ce sont les anticorps de capture (en excès). On incube l’échantillon contenant les antigène sur ce support. Après lavage, on incorpore des anticorps de détection qui sont couplés et donneront un produit coloré, permettant le dosage.

      Dosage ELISA en sandwich

      Cette technique est très similaire à l’ELISA classique sauf qu’au lieu d’incorporer un anticorps de détection directement après l’anticorps de capture, il y a un anticorps secondaire qui entre en jeu et qui sera reconnu par l’anticorps de détection.

      • Seuil de détection : plus faible concentration en antigène détectable.
      • Sensibilité : plus petite différence de concentration.

      ELISA Indirecte (dosage d’anticorps)

      Une surface est activée par un antigène reconnu par l’anticorps d’intérêt. Les immunoglobulines vont donc se fixer et selon la spécificité de l’anticorps de révélation, on permet le dosage des immunoglobulines totales ou le dosage d’une classe ou d’une sous classe d’immunoglobuline.

      Le phénomène de saturation nous donne un même résultat (valeur maximum) pour tous les échantillons insuffisamment dilués.

      La formation de produit coloré est provoquée par l’enzyme attachée à l’anticorps de révélation et permet la mesure en colorimétrie (DO) ou en luminométrie.

      b) Western blot (ou immuno empreinte)

      L’objectif d’un Western blot est de détecter et/ou quantifier une protéine d’intérêt dans des cellules ou un tissu etc.

      Cette méthode consiste à faire migrer des protéines dans le gel en fonction de leur poids moléculaire ou de leur charge. On transfère ensuite les protéines sur une membrane et l’on réalise alors une immuno-révélation :

      • Liaison de l’antigène d’intérêt avec un anticorps primaire
      • Ajout d’un anticorps secondaire couplé à une enzyme qui va permettre la révélation
      • Révélation

      d) Précipitation de complexe protéine/protéine ou protéine/ADN

      Recherche d’interaction entre protéines par co-immunoprécipitation

      Des extraits cellulaires (contenant des protéines) sont incubés avec des billes couplés aux anticorps dirigés contre la protéine d’intérêt.

      Si on observe que 2 protéines sont capturées en même temps, on en déduit qu’il existe dans la cellule une interaction entre ces protéines.

      Sur ce schéma par exemple, on s’intéresse aux protéines rouges, violettes et bleues  : il y a bien interaction entre ces trois protéines=.

      5. Immunomarquage

      a) Immunomarquages directs et indirects

      • Immunomarquage direct : l’anticorps primaire est couplé à un système de révélation
      • Immunomarquage indirect : l’anticorps primaire n’est pas couplé mais est reconnu par un anticorps secondaire qui est couplé.

      On peut choisir de réaliser la réaction avec un agent perméabilisant afin de marquer les protéines intracellulaires. Sinon, les anticorps ne pénètrent pas la cellule et on ne peut détecter que les protéines de surface.

      b) Techniques de détection

      Immunofluorescence

      Ce terme désigne l’utilisation d’anticorps couplés à un fluorochrome : FITC, Rhodamine etc.

      La visualisation des résultats se fait à l’aide d’un microscope à épifluorescence.

      Les observations sont de 2 types :

      On peut également mesurer des intensités de fluorescence avec la cytométrie de flux lorsque la technique n’est pas l’immuno-marquage : étude des flux calciques, du cycle cellulaire etc.

      Immuno-histochimie

      Sur une coupe de tissu, on recherche un antigène d’intérêt par immunomarquage.

      Cette méthode permet le diagnostic et le suivi des cancers.

      Immuno-microscopie électronique

      On réalise un immuno-marquage à l’aide d’anticorps couplés à une bille d’or, opaque aux e.

      3. Contrôle des réactions non-spécifiques

      Pour tout immunomarquage, il existe un risque de fixation non spécifique des anticorps : primaire, secondaire, interaction avec un récepteur au fragment constant.. Différentes méthodes permettent d’éviter ce signal :

      • Utilisation de récepteur au fragment constant (blocker : des anticors anti-FcR permettent d’empêcher toute fixation parasite sur le FcR. CFR=
      • Utilisation d’un anticorps de type Fab’2 : c’est un anticorps privé du fragment constant, ce qui empêche sa fixation sur le FcR.
      • Lavages et utilisation d’un détergent pour décrocher les Ac faiblement fixés.